Сотрудники ФГБУ «ВНИИКР» прошли обучение по новым методам диагностики на основе ДНК в Нидерландах

В октябре 2019 года в Вестердийском институте биоразнообразия грибов (г. Утрехт) состоялись курсы повышения квалификации по теме «Идентификация грибов на основе ДНК».

Специалисты Испытательного экспертного центра подведомственного Россельхознадзору Всероссийского центра карантина растений (ФГБУ «ВНИИКР») приняли участие в обучении новым методам диагностики.

В рамках курсов повышения квалификации были рассмотрены следующие темы:

1. Направления и развитие диагностики пищевых продуктов

Диагностика пищевых продуктов – это относительно новая и развивающаяся область, в значительной степени подпитываемая постоянно растущим спросом на продовольственную безопасность. Хорошо известно, что традиционные методы микробиологического обнаружения и идентификации микроорганизмов отнимают много времени, являются трудоемкими и все чаще воспринимаются как недостаточные для удовлетворения требований быстрого тестирования пищевых продуктов. В последнее время были разработаны различные виды методов быстрого обнаружения, идентификации и мониторинга пищевых микроорганизмов, включая методы на основе нуклеиновых кислот, иммунологические методы, методы на основе биосенсоров и т.д. В данной теме был представлен обзор принципов, характеристик и применения методов быстрого обнаружения.

2. Молекулярная идентификация пищевых продуктов и грибов

Идентификация неизвестных изолятов имеет важное значение, и название патогена открывает огромное количество дополнительной информации. Сведения об экологии вида и данные, например, о термостойкости или устойчивости к консервантам, способности расти при низких температурах и производстве микотоксинов могут быть получены при

правильной идентификации, и эта информация может напрямую влиять на принятие решений. Идентификация, основанная на фенотипических признаках, может занимать много времени, а также необходим хорошо обученный персонал, и поэтому она чаще оказывается ошибочной, чем идентификация на основе последовательности. Один или несколько генов или локусов секвенируются для идентификации, и выбор мишени для последовательности, зависит от рода/вида патогена. Кроме того, результат идентификации на основе последовательности в значительной степени зависит от качества базы данных.

В данной теме была дана информация о том, как производить надежную идентификацию вида с использованием последовательностей. Дополнительно была предоставлена информация о типировании штамма. Различение между различными штаммами одного и того же вида используется для понимания генетического разнообразия агентов, вызывающих порчу (загрязнение вызвано одним и тем же штаммом), или может использоваться для отслеживания источника загрязнения. Идентификация и ввод – это два перекрывающихся поля, а поля и типирование часто следуют за идентификацией. За прошедшие годы было разработано множество различных методов типирования и был дан обзор преимуществ и недостатков наиболее часто используемых методов типирования (полиморфизм длин амплифицируемых фрагментов (AFLP), мультилокусное секвенирование-типирование (MLST) и анализ коротких тандемных повторов (STR)).

3. MALDI-TOF MS и другие протеомные подходы для идентификации пищевых грибов и дрожжей

MALDI-TOF MS можно использовать для идентификации бактерий, дрожжей и некоторых грибов. MALDI-TOF MS имеет короткое время процесса и может быть надежным. Методика позволяет измерять разницу в размерах биомолекул (например, белков, пептидов, биомаркеров гликопротеинов, сахаров) и органических молекул. MALDI-TOF MS успешно применяется для обычной идентификации пищевых дрожжей и имеет

приложения для идентификации нитчатых грибов. Важным этапом в процессе идентификации с использованием MALDI-TOF MS является сравнение сгенерированного спектра с эталонной базой данных масс-спектров. Качество и разнообразие видов / штаммов в базе данных имеют важное значение для правильной идентификации. Наряду с базой данных важны технические изменения, возникающие в результате процедуры подготовки образца. Это может отрицательно повлиять на качество спектров и, следовательно, на идентификацию.

4. Выравнивание последовательности ДНК и построение филогенетических деревьев

Выравнивание множественных последовательностей (MSA) обычно представляет собой выравнивание двух или более биологических последовательностей (белка или нуклеиновой кислоты). Из полученных результатов можно сделать вывод о гомологии и об эволюционных отношениях между изученными последовательностями. Различные алгоритмы могут быть использованы для выравнивания последовательностей, и они оказывают различное влияние на конечный результат, филограмму.

5. Применение секвенирования нового поколения для определения качества и безопасности пищевых продуктов

Молекулярные методы обнаружения и идентификации грибов и дрожжей в испорченных продуктах или в помещении могут быть быстрее, чем обычные методы. Одним из преимуществ методов на молекулярной основе, особенно на основе ПЦР, является специфическое обнаружение небольших количеств организмов-мишеней путем амплификации их ДНК за короткий промежуток времени. Наиболее распространенные используемые методы – это обычные ПЦР-анализы и ПЦР-анализы в реальном времени, но секвенирование ДНК нового поколения становится все более распространенным.

Секвенирование нового поколения позволяет получить подробную информацию о геноме организмов / популяций; о генах вирулентности,

устойчивости; об экспрессии генов организмов / популяций; о реакции организмов на условия окружающей среды; о составе сложных бактериальных (16S рДНК) или грибных (ITS) популяций.

В процессе обучения были проведены два практических занятия по темам:

— анализ BLAST, идентификация патогенов на основе последовательности;

— выравнивание последовательности ДНК и филогенетический анализ.

В рамках этих практических занятий были подробно разобраны основные принципы и способы работы с BLAST NCBI и MEGA7 по выравниванию нуклеотидных последовательностей и построению филогенетических деревьев.

Полученная информация будет применена учеными и специалистами Всероссийского центра карантина растений при проведении прикладных научных исследований, для усовершенствования выполнения научно-исследовательских работ по текущим и перспективным научным темам, а также при подготовке учебных программ для курсов повышения квалификации на базе Образовательного центра ФГБУ «ВНИИКР».